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JACS：功能DNA調(diào)節(jié)的CRISPR-Cas12a感應(yīng)器用于非核酸目標(biāo)的即時診斷

來源：化學(xué)加（ID：tryingchem）      2019-12-23
導(dǎo)讀：除了其非凡的基因組編輯能力外，CRISPR-Cas系統(tǒng)還以其高堿基分辨率和等溫信號放大開啟了生物傳感應(yīng)用的新時代。然而，目前報道的CRISPR-Cas傳感器大多只用于核酸的檢測，對非核酸目標(biāo)的應(yīng)用有限。近日，南京大學(xué)張晶晶教授課題組、美國伊利諾伊大學(xué)厄巴納-香檳分校陸藝教授課題組和南昌大學(xué)熊勇華教授課題組合作在J. Am. Chem. Soc.上報道了功能DNA分子調(diào)節(jié)的CRISPR-Cas12a感應(yīng)器用于非核酸目標(biāo)的即時診斷的新研究成果（DOI：10.1021/jacs.9b09211）。

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圖片來源：J. Am. Chem. Soc.

最近發(fā)現(xiàn)和發(fā)展的規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（CRISPR）和CRISPR關(guān)聯(lián)蛋白（Cas）統(tǒng)稱為CRISPR-Cas系統(tǒng)，不僅改變了基因組編輯，也改變了包括醫(yī)學(xué)診斷在內(nèi)的其他領(lǐng)域。例如，基于SHERLOCK (Specific High-sensitivity enzymatic Reporter UnLOCKing, 特異性高靈敏度酶促解鎖)和DETECTR (DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter, DNA內(nèi)切酶靶向的CRISPR反式報告檢測系統(tǒng)) 的核酸傳感器。在這類傳感器中CRISPR- cas12a (Cpf1)是一類與單鏈導(dǎo)向的CRISPR RNA (crRNA)結(jié)合的2型V-A CRISPR相關(guān)酶。據(jù)報道，CRISPR- cas12a不僅可以像許多其他CRISPR- cas系統(tǒng)那樣對目標(biāo)DNA進行剪切，而且可以不加選擇地對目標(biāo)DNA附近的任何非目標(biāo)ssDNA進行剪切。這種非目標(biāo)ssDNA被附帶剪切可以顯著提高DNA檢測的靈敏度。幾乎所有報道的CRISPR-Cas傳感器都是用來檢測核酸相關(guān)目標(biāo)的。因此，在可激活的CRISPR傳感器的設(shè)計中仍然需要更多的策略，這些策略可以應(yīng)用于核酸之外更廣泛的目標(biāo)。
為了充分發(fā)揮CRISPR技術(shù)在診斷應(yīng)用中的潛力，作者基于靶向響應(yīng)的功能DNAs(fDNAs)設(shè)計出可激活的CRISPR-Cas感應(yīng)器。之所以選擇fDNA，是因為它們被證明可以選擇性地結(jié)合多種非核酸靶標(biāo)，包括有機小分子、金屬離子、蛋白質(zhì)、病毒，甚至細(xì)胞，并且能從大型DNA文庫中進行體外選擇來獲得。通過將fDNA與CRISPR-Cas12a結(jié)合，作者證明了這個系統(tǒng)可以使用核酸配體激活的CRISPR-Cas12a來檢測和量化小的有機分子，用脫氧核酶激活的CRISPR-Cas12a來檢測金屬離子。
fDNA調(diào)節(jié)的CRISPR-Cas感應(yīng)器由探針系統(tǒng)和報告系統(tǒng)兩部分組成。探針系統(tǒng)包含fDNA和CRISPR-Cas12a的DNA啟動子，報告系統(tǒng)包含crRNA預(yù)組裝的Cas12a效應(yīng)分子和被熒光團和淬滅劑標(biāo)記的單鏈DNA (ssDNA)熒光報告基因(ssDNA-FQ)。在非核酸靶標(biāo)缺失的情況下，fDNA以高于環(huán)境溫度的解鏈溫度與DNA啟動子結(jié)合，阻止其與Cas12a-crRNA復(fù)合物結(jié)合(Locked Activator)。因此，Cas12a的側(cè)裂活性無法被激活，使得ssDNA- FQ報告基因保持完整。完整的ssDNA- FQ上淬滅劑靠近熒光團，從而導(dǎo)致ssDNA熒光報告基因的熒光增加可以忽略。另一方面，在非核酸靶標(biāo)存在的情況下，與fDNA結(jié)合的靶標(biāo)可以使fDNA/DNA啟動子的解鏈溫度降低到環(huán)境溫度以下，因此，DNA啟動子可以與fDNA雜交，成為“Open Activator”，與Cas12a結(jié)合并激活Cas12a。在這種情況下，ssDNA報告基因可以被裂解，導(dǎo)致熒光團與淬滅劑分離，從而產(chǎn)生明顯的熒光信號。
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 圖片來源：J. Am. Chem. Soc.
為了論證上述fDNA調(diào)控的CRISPR-Cas12a感應(yīng)器用于檢測非核酸目標(biāo)，作者首先選擇了應(yīng)用最廣泛、研究最深入的腺苷5 -三磷酸腺苷(ATP)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換適配體作為檢測目標(biāo)。為了使基于CRISPR的ATP感應(yīng)器具有良好的分析性能，作者設(shè)計了特定的ATP配體。該ATP配體能夠與啟動子雜交，有效阻斷啟動子與crRNA的結(jié)合，還能夠以結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的方式有效地釋放啟動子以響應(yīng)ATP目標(biāo)。在ATP不存在的情況下，DNA啟動子被ATP適配體雜交所鎖定，不能結(jié)合crRNA激活Cas12a-crRNA的側(cè)鏈裂解活性。在ATP存在的情況下，ATP適配體與ATP結(jié)合導(dǎo)致ATP適配體構(gòu)象改變，這弱化了ATP適配體與DNA啟動子雜交的能力。這使得DNA啟動子可以在開放狀態(tài)下釋放，從而觸發(fā)Cas12a-crRNA的側(cè)裂活動。隨后作者用電泳和熒光證實了適配體調(diào)控Cas12a-crRNA的激活。
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 圖片來源：J. Am. Chem. Soc.
為了確定適配體調(diào)控的CRISPR-Cas12a感應(yīng)器能否定量檢測ATP，作者首先測量了不同濃度ATP在HEPES緩沖液中的熒光光譜。結(jié)果表明，熒光信號隨著ATP濃度（0.39 μM~50 μM）的增加而增強。接著，作者對適配體調(diào)節(jié)的CRISPR-Cas12a感應(yīng)器的選擇性進行了研究。作者使用不同的競爭核苷酸-三磷酸類似物，如 GTP、CTP和UTP，進行了熒光分析。結(jié)果顯示類似物組沒有明顯熒光增強，而ATP組熒光增強了10倍。這表明，ATP適配體的高選擇性在適配體調(diào)控的CRISPR-Cas12a感應(yīng)器中得到保留。隨后，作者利用人的血漿驗證了適配體調(diào)節(jié)的CRISPR-Cas12a感應(yīng)器在實際樣品中的應(yīng)用可行性，并與商業(yè)試劑對比驗證感應(yīng)器的準(zhǔn)確性和可靠性。結(jié)果顯示CRISPR-Cas12a感應(yīng)器可以克服人體血漿中其它成分的干擾，可以準(zhǔn)確，可靠的即時檢測非核酸目標(biāo)。
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 圖片來源：J. Am. Chem. Soc.
受到上述用適配體調(diào)控的CRISPR-Cas12a感應(yīng)器檢測ATP成功的鼓舞，作者使用商用便攜式熒光儀在人血漿樣本中進行了類似的測試。結(jié)果表明，在不同濃度的DNA啟動子的作用下，傳感器的熒光增強速度較快。此外，利用便攜式熒光儀的快速熒光動力學(xué)測量，酶解所需時間進一步縮短到5分鐘。
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 圖片來源：J. Am. Chem. Soc.
最后，為了證明fDNA調(diào)控的CRISPR-Cas12a感應(yīng)器的通用性，作者將該方法從適配體擴展到DNA酶來檢測金屬離子，如Na +。為了檢測Na +，作者設(shè)計了Na +特異性DNA酶的模板鏈（NaA43S′）。NaA43S′的5′端修飾有DNA啟動子序列，其3′被生物素標(biāo)記。這樣NaA43S′可以通過解鏈溫度比室溫高的18堿基對與酶鏈(NaA43E′)雜交。在缺乏Na +的情況下，模板鏈表現(xiàn)出最小的熒光信號，因為DNA啟動子被DNA酶鎖定。在Na +存在的情況下，NaA43S′被NaA43E′切成兩半，DNA啟動子被釋放。釋放的啟動子與Cas12a-crRNA復(fù)合物進一步結(jié)合，激活Cas12a的側(cè)裂活性，導(dǎo)致熒光信號的出現(xiàn)。結(jié)果表明，CRISPR-Cas12a感應(yīng)器可以精確檢測金屬離子。
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 圖片來源：J. Am. Chem. Soc.
總結(jié)：南京大學(xué)張晶晶教授課題組、美國伊利諾伊大學(xué)厄巴納-香檳分校陸藝教授課題組和南昌大學(xué)熊勇華教授課題組合作展示了一個通用的功能DNA調(diào)節(jié)的CRISPR-Cas感應(yīng)器用于定量檢測兩個非核酸目標(biāo)。該設(shè)計策略可以將這個強大的CRISPR-Cas感應(yīng)器系統(tǒng)擴展到其他目標(biāo)。

撰稿人：犟子柳


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