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中科院化學(xué)所馬會民課題組JACS:雙功能探針揭示鐵死亡伴隨?OH產(chǎn)生和細(xì)胞質(zhì)粘滯度增加

來源:化學(xué)加(ID:tryingchem)      2019-11-12
導(dǎo)讀:近日,中科院化學(xué)所馬會民研究員課題組在鐵死亡機(jī)制方面取得新進(jìn)展。他們利用自己設(shè)計(jì)的雙功能熒光探針(H-V)實(shí)現(xiàn)了鐵死亡過程中羥基自由基(?OH)產(chǎn)生和細(xì)胞粘滯度改變的同時(shí)檢測,揭示了鐵死亡伴隨著羥基自由基產(chǎn)生和細(xì)胞質(zhì)粘滯度增加。這是首次報(bào)道單個(gè)探針就可以實(shí)現(xiàn)對鐵死亡過程發(fā)生的多種變化進(jìn)行追蹤、檢測。該成果發(fā)表于JACS上。(DOI: 10.1021/jacs.9b09722)。


圖1.同時(shí)對細(xì)胞質(zhì)粘滯度和羥基自由基成像示意圖

(圖片來源J. Am. Chem. Soc.)

鐵死亡是2012年發(fā)現(xiàn)的一種不同于經(jīng)典的caspase依賴性凋亡途徑而調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的方式。鐵死亡依賴于鐵離子,會發(fā)生脂質(zhì)過氧化。脂質(zhì)過氧化物的積累是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要原因。研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡過程中脂質(zhì)過氧化與活性氧有關(guān),但是哪種活性氧發(fā)揮關(guān)鍵作用還不清楚。羥基自由基作為活性最高的活性氧是否在鐵死亡過程中造成脂質(zhì)過氧化還缺少相關(guān)研究。

細(xì)胞內(nèi)粘滯度是生物活性物質(zhì)擴(kuò)散和信號傳遞等多種細(xì)胞過程的基本因子。細(xì)胞粘滯度的異常變化可能與某些疾病有關(guān)。此外,胞質(zhì)粘滯度增加是細(xì)胞收縮和胞質(zhì)濃縮導(dǎo)致的凋亡的重要形態(tài)學(xué)特征。由于鐵死亡在形態(tài)學(xué)上與凋亡不同,因此揭示鐵死亡是否與細(xì)胞粘滯度改變有關(guān)具有重要意義。

目前的熒光探針只能單獨(dú)檢測羥基自由基產(chǎn)生或細(xì)胞質(zhì)粘滯度變化。這使得檢測過程復(fù)雜,也無法準(zhǔn)確揭示羥基自由基與細(xì)胞質(zhì)粘滯度在鐵死亡過程中的關(guān)系。因此,馬會民課題組開發(fā)了熒光探針(H-V)實(shí)現(xiàn)了對鐵死亡過程中羥基自由基和細(xì)胞質(zhì)粘滯度的同時(shí)成像。

作者利用分子轉(zhuǎn)子策略和芳環(huán)羥基化設(shè)計(jì)出探針H-V。分子轉(zhuǎn)子有兩個(gè)對稱的小π-共軛。在分子轉(zhuǎn)子中,吲哚部分是電子受體,苯甲醚是電子供體,它們是通過可旋轉(zhuǎn)的乙烯基鍵形成D-π-A結(jié)構(gòu)連接起來的。隨著微環(huán)境粘滯度的增加,分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受到限制,從而抑制了非輻射過程中分子內(nèi)扭轉(zhuǎn)電荷轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致探針熒光增強(qiáng)。另一方面,芳環(huán)的羥基化被用來提高檢測?OH的選擇性,而強(qiáng)供給電子基(甲氧基)的加入能夠增強(qiáng)探針對?OH的捕獲能力,提高檢測靈敏度。此外,探針H-V中還引入了兩個(gè)磺酸鹽基團(tuán)來中和正電荷。在H-V的donor-two-acceptors結(jié)構(gòu)中, ?OH造成的羥基化主要發(fā)生在甲氧基的間位上,形成苯酚中間體,然后發(fā)生去質(zhì)子化和電子重排,最終形成一個(gè)大π共軛系統(tǒng)(product 1)。從探針H-V到product 1光譜發(fā)生很大的紅移,并且有很鮮明的近紅外熒光變化,從而實(shí)現(xiàn)用獨(dú)立的通道檢測?OH,避免了粘滯度檢測通道的交叉信號。


圖2. H-V對粘滯度和羥基自由基響應(yīng)的機(jī)理

(圖片來源J. Am. Chem. Soc.)

在探針被合成出來之后,作者首先研究了探針H-V對粘滯度的響應(yīng)情況。探針H-V的紫外吸收在400 nm,而在520 nm處有微弱的熒光發(fā)射。作者以甲醇甘油體系模擬粘滯度,研究發(fā)現(xiàn)隨著粘滯度的增加,520 nm處的熒光顯著增強(qiáng)。在純甘油中的熒光比在純甲醇中的熒光增加了50倍。這表明探針H-V對粘滯度非常敏感。隨后,作者研究了探針H-V對?OH的響應(yīng)情況。作者用芬頓反應(yīng)提供?OH。隨著芬頓試劑的增加,在652 nm處的熒光顯著增強(qiáng),最高增強(qiáng)了450倍。而在其他活性氧的反應(yīng)中,并沒有明顯的熒光增強(qiáng)。這表明探針H-V對?OH有非常高的選擇性。


圖3. 探針對粘滯度和羥基自由基響應(yīng)的熒光變化

(圖片來源J. Am. Chem. Soc.)

在研究了探針H-V對粘滯度和?OH的響應(yīng)情況之后,作者利用探針H-V進(jìn)行活細(xì)胞的?OH和細(xì)胞質(zhì)粘滯度的獨(dú)立成像。有報(bào)道表明隨著培養(yǎng)溫度的降低,細(xì)胞質(zhì)粘滯度升高。成像結(jié)果表明,綠色通道的熒光強(qiáng)度隨著孵育溫度的降低而增強(qiáng),而紅色通道的熒光強(qiáng)度沒有變化。這些結(jié)果表明,H-V能特異性地成像細(xì)胞質(zhì)粘滯度的變化。另一方面,?OH成像結(jié)果顯示,紅色通道的熒光強(qiáng)度時(shí),綠色通道熒光強(qiáng)度無顯著變化。這表明,H-V適用于細(xì)胞內(nèi)?OH的獨(dú)立成像。


圖4. 探針對細(xì)胞質(zhì)粘滯度和羥基自由基的獨(dú)立成像

(圖片來源J. Am. Chem. Soc.)

在獨(dú)立成像的基礎(chǔ)上,作者研究了在鐵死亡過程中,探針H-V對細(xì)胞質(zhì)粘滯度和?OH的成像。作者利用erastin誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡,收集兩個(gè)獨(dú)立通道的熒光信號,同時(shí)監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)?OH的特異性變化和粘滯度變化。隨著erastin孵育的時(shí)間增長,紅色和綠色通道的熒光強(qiáng)度都增強(qiáng),而使用鐵死亡抑制劑(DFO,F(xiàn)er-1,Lip-1)后,熒光強(qiáng)度受到顯著抑制。上述結(jié)果表明,鐵死亡伴隨著胞漿粘滯度增加和?OH生成。


圖5.鐵死亡中H-V對細(xì)胞質(zhì)粘滯度和?OH的成像

(圖片來源J. Am. Chem. Soc.)

總結(jié):中科院馬會民課題組用雙功能熒光探針H-V監(jiān)測鐵死亡過程中細(xì)胞內(nèi)?OH和粘滯度的變化,首次實(shí)現(xiàn)使用單一探針同時(shí)監(jiān)測鐵死亡中?OH和粘滯度的變化并揭示了鐵死亡伴隨著羥基自由基產(chǎn)生和細(xì)胞質(zhì)粘滯度增加。


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