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調(diào)節(jié)細胞死亡的各種機制包括脂質(zhì)過氧化物和一氧化氮等氧化介質(zhì)的形成。在這方面，15-脂氧合酶-1(15-LOX-1)是催化脂質(zhì)過氧化物生成的關(guān)鍵酶。這些過氧化物的作用與核因子-κb（NF-κb）信號和NO的產(chǎn)生有關(guān)，而抑制15-LOX-1可以阻止在炎癥條件下的細胞死亡。

NF-κb通路的激活導(dǎo)致下游基因的轉(zhuǎn)錄，如在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）。iNOS催化NO自由基的形成，而NO自由基在許多生理過程中起著關(guān)鍵作用。另一方面，過量的NO生成會導(dǎo)致活性氮物質(zhì)（RNOS）的形成，從而導(dǎo)致細胞死亡和組織損傷。活性氧（ROS），如脂質(zhì)過氧化物，已被證明能增強LPS介導(dǎo)的NF-κb活化，從而增加NF-κb靶基因的表達。15-LOX-1是一種由多不飽和脂肪酸如花生四烯酸(AA)和亞油酸(LA)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物的非血紅素鐵酶。15-LOX-1氧化AA生成相應(yīng)的15-羥基二十碳四烯酸或氧化LA，生成相應(yīng)的13-羥基十八碳二烯酸(13-HpODE)。如果細胞抗氧化系統(tǒng)不能平衡脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，這就會導(dǎo)致嗜鐵蛋白細胞死亡和NF-κb通路的激活。從而在調(diào)節(jié)細胞死亡的兩種機制之間提供協(xié)同串擾。因此，15-LOX-1是許多疾病中氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)細胞死亡的關(guān)鍵酶。

（來源：J. Med. Chem.）

Frank J. Dekker課題組研究了吲哚核的新取代及其結(jié)構(gòu)?活性關(guān)系的研究對于15-LOX-1的抑制。將最有效的抑制劑以264.7巨噬細胞為研究模型探索了對細胞15-LOX-1的抑制作用以及對活性氧形成的影響，以了解這種抑制劑的細胞效力。

首先，作者對設(shè)計的吲哚類似物進行篩選，最終確認化合物9c（i472）是最有效的15-LOX-1抑制劑，IC₅₀值為0.19（Figure 1）。接著，作者進一步研究了抑制劑9c（i472）對細胞LOX活性的抑制作用。作者測試了巨噬細胞內(nèi)9c對脂氧化酶的抑制作用（Figure 5），結(jié)果顯示鏈霉親和素?辣根過氧化物酶檢測到的基于活性的脂氧合酶標記帶的強度降低。表明9c能抑制細胞內(nèi)脂氧合酶的活性。

 Figure 1.IC₅₀ Values against 15-LOX-1 with Different Analogues  （來源：J. Med. Chem.）

（來源：J. Med. Chem.）

之后，作者在細胞基礎(chǔ)上研究這種化合物的潛在作用。作者推測15-LOX-1抑制劑可以抑制細胞內(nèi)脂氧化物的形成，從而阻止嗜熱細胞死亡。另外，作者期望這種機制將與NF-κb通路產(chǎn)生串擾。因為NF-κb通路的激活也會導(dǎo)致細胞死亡。作者利用LPS誘導(dǎo)細胞死亡，通過加入15-LOX-1抑制劑來觀察細胞存活率，以此來判斷抑制劑的效力。結(jié)果顯示（Figure 7），15-LOX抑制劑Zileuton和先前鑒定的15-LOX-1抑制劑Eeftheriadis-14d可提高LPS處理的264.7巨噬細胞的存活率，而抑制劑9c（i472）表現(xiàn)出更強的活性。

（來源：J. Med. Chem.）

為了進一步觀察保護LPS誘導(dǎo)細胞死亡的機制，作者考察了9c對NF-κB通路的影響。用LPS、干擾素γ（IFNγ）和抑制劑9c（i472）刺激細胞。結(jié)果顯示，9c對LPS/INFγ刺激NF-κb轉(zhuǎn)錄激活有顯著但不完全的抑制作用（Figure 8）。

（來源：J. Med. Chem.）

iNOS基因轉(zhuǎn)錄與NO的產(chǎn)生有關(guān)，而NO對免疫應(yīng)答和凋亡有重要調(diào)節(jié)作用，作者比較了9c（i472）對264.7巨噬細胞硝酸鹽與亞硝酸鹽比值的抑制作用（Figure 10）。結(jié)果表明，9c（i472）作為一種15-LOX-1抑制劑，對NO的產(chǎn)生具有劑量依賴性的抑制作用，這與NF-κb活性降低和iNOS基因表達的結(jié)果一致。

（來源：J. Med. Chem.）

氧化應(yīng)激通過產(chǎn)生脂氧化物而產(chǎn)生毒性作用，是造成細胞死亡的重要途徑。作者在RAW 264.7細胞中測試了9c對脂質(zhì)過氧化作用的影響，利用熒光染料二吡咯二氟化硼（BODIPY）581/591 C11和熒光激活細胞分類術(shù)（FACS）進行觀察。結(jié)果顯示（Figure 11），9c與抑制劑PD-146176在5μM濃度下有相當?shù)臏p弱脂質(zhì)氧化物的促進作用。與15-LOX抑制劑Zileuton相比，兩種15-LOX-1抑制劑對脂質(zhì)過氧化均表現(xiàn)出更強的促進作用，雖然15-LOX-1不是唯一能觸發(fā)脂質(zhì)過氧化物形成的途徑，但這些結(jié)果表明對15-LOX-1的抑制對模型系統(tǒng)中的脂質(zhì)過氧化有很強的影響。

（來源：J. Med. Chem.）

總結(jié)：格羅寧根大學(xué)Frank J. Dekker課題組將化合物9c（i472）作為一種具有新的取代基型（IC₅₀=0.19μm）的強效15-LOX-1抑制劑，并對其進行了研究。通過基于活性的標記，作者證明了抑制劑9c（i472）能夠抑制細胞內(nèi)的脂氧合酶。該化合物的進一步表征表明，它能夠保護264.7巨噬細胞免受LPS誘導(dǎo)的細胞死亡。探討了抑制劑9c（i472）對不同細胞死亡途徑的影響。包括NF-κb的激活、iNOS的表達和NO的形成，這些都是可以觸發(fā)細胞死亡的一系列因素。結(jié)果顯示，抑制劑9c（i472）可能通過串擾機制影響NO的產(chǎn)生和脂質(zhì)的過氧化。

撰稿人：安fen