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周環(huán)反應(yīng)是一類在反應(yīng)過程中形成環(huán)狀過渡態(tài)的協(xié)同反應(yīng)，比如著名的[4+2]環(huán)加成反應(yīng)（Diels-Alder反應(yīng)）、Cope-重排反應(yīng)、Claisen-重排反應(yīng)等，這些反應(yīng)在有機合成中有著廣泛的應(yīng)用。有意思的是，在自然界中也觀察到了可催化這些著名周環(huán)反應(yīng)的酶。早在1965年，Woodward和Hoffmann兩位諾貝爾化學(xué)獎獲得者就預(yù)測了[6+4]或其它高階環(huán)加成反應(yīng)可以發(fā)生，隨后在有機合成中確實觀察到了[6+4]反應(yīng)，但自然界中是否存在著可催化[6+4]反應(yīng)的酶仍然是個謎。

南京大學(xué)戈惠明、譚仁祥和梁勇研究團隊在前期工作中，從海洋放線菌中發(fā)現(xiàn)了一個具有抗幽門螺旋桿菌活性的新穎大環(huán)內(nèi)酯化合物命名為streptoseomycin，根據(jù)其結(jié)構(gòu)推斷，它在微生物體內(nèi)的合成過程中可能涉及[4+2]環(huán)加成反應(yīng)。為鑒定此過程，他們比較分析了streptoseomycin以及其結(jié)構(gòu)類似物nargenicin的生物合成基因簇，推測一個未知功能的同源蛋白StmD、NgnD很有可能分別負責(zé)streptoseomycin和nargenicin中的環(huán)化反應(yīng)。然而，敲除stmD基因并未得到預(yù)料中的環(huán)化產(chǎn)物前體3，而得到了線性化合物4和5，這很可能是化合物3環(huán)內(nèi)雙鍵較多，張力較大，自發(fā)水解開環(huán)所致。研究人員設(shè)計了一個在微生物體內(nèi)驗證StmD功能的實驗，首先敲除了基因簇上大部分基因，僅留下聚酮合成酶基因，此突變株只產(chǎn)生化合物4；當(dāng)將stmD基因回補回去時，得到了化合物6?8，其中化合物7不穩(wěn)定，可經(jīng)Cope重排轉(zhuǎn)化成6。該結(jié)果表明，聚酮合成酶的直接產(chǎn)物是3，若無下游其它酶存在時，3將發(fā)生水解開環(huán)而生成4；若再引入StmD，則催化發(fā)生周環(huán)反應(yīng)，奇怪的是，該酶不僅催化了[4+2]反應(yīng)，也催化了[6+4]反應(yīng)。

隨后，研究人員設(shè)計了兩步串聯(lián)的酶反應(yīng)在體外來驗證周環(huán)酶的催化功能。首先，通過聚酮合成酶上的硫酯酶結(jié)構(gòu)域催化鏈狀化合物4-SNAC環(huán)化形成3，當(dāng)同時加入StmD或NgnD時，反應(yīng)體系中觀察到了化合物6?8的生成，確證StmD或NgnD可同時催化[4+2]和[6+4]反應(yīng)。此外研究人員以StmD為探針從公共基因組數(shù)據(jù)庫中，挖掘鑒定出了另外三個可催化此反應(yīng)的酶。

為了更好地理解[6+4]、[4+2]環(huán)加成反應(yīng)和[3,3]-Cope重排反應(yīng)之間的相互關(guān)系，研究人員通過密度泛函理論計算了反應(yīng)的熱力學(xué)和動力學(xué)。有趣的是，底物3越過單一過渡態(tài)后可歧化成兩個方向，分別生成[6+4]、[4+2]反應(yīng)產(chǎn)物，由于[6+4]化合物在熱力學(xué)上更穩(wěn)定，[4+2]產(chǎn)物可再經(jīng)Cope重排自發(fā)轉(zhuǎn)化成[6+4]產(chǎn)物。此理論計算結(jié)果與實驗觀察結(jié)果相吻合，進一步證明了之前的推斷。

最后，研究者獲得了StmD、NgnD和101015D三個蛋白的晶體來進一步研究該反應(yīng)的催化機理。通過分子對接、計算機模擬和點突變實驗，闡明了此類新型環(huán)加成酶的反應(yīng)機制。M69中富含電子的硫原子會特定的指向過渡態(tài)中部分帶正電的雙烯部分，從而產(chǎn)生有利的靜電作用；同時反應(yīng)物中部分帶負電的三烯酯會與W67上的芳香環(huán)產(chǎn)生π–π堆疊相互作用，來穩(wěn)定過渡態(tài)并加速整個反應(yīng)的進行。此外，Y55和Y13也會通過分子間氫鍵和CH–π相互作用來催化反應(yīng)。

綜上所述，研究人員巧妙設(shè)計實驗，通過體內(nèi)敲除基因、體外酶催化反應(yīng)、量子化學(xué)計算、分子動力學(xué)模擬以及蛋白晶體的研究等，表征了首例可催化[6+4]/[4+2]環(huán)加成反應(yīng)的酶。這類酶的發(fā)現(xiàn)將進一步拓展人們對周環(huán)反應(yīng)酶的認識，啟發(fā)科學(xué)家們將來利用和改造周環(huán)反應(yīng)酶來實現(xiàn)有價值的分子轉(zhuǎn)化。

該研究得到了國家重點研發(fā)計劃，國家自然科學(xué)基金委優(yōu)青項目、重點項目，江蘇省特聘教授計劃等的資助，特別感謝南京大學(xué)配位化學(xué)國家重點實驗室以及醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室，以及人工微結(jié)構(gòu)科學(xué)與技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心高性能計算中心和南京大學(xué)高性能計算中心提供的服務(wù)。