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氫酶是一類能夠催化氫分子可逆生成和裂解的生物催化劑，目前已知的氫酶根據(jù)其活性中心金屬不同可以分為三大類：鎳鐵氫酶、鐵鐵氫酶和單鐵氫酶。發(fā)現(xiàn)最晚的單鐵氫酶在催化中心結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制上與其他兩類氫酶具有明顯區(qū)別。首先，在結(jié)構(gòu)上，單鐵氫酶的金屬活性中心只有一個二價鐵離子，而且不含有傳遞電子的鐵硫簇。其次，單鐵氫酶的單金屬活性中心可以直接異裂氫氣生成Fe-H中間體，進(jìn)而轉(zhuǎn)移氫負(fù)離子到底物上，該過程與傳統(tǒng)貴金屬氫化催化劑類似。這樣的催化機(jī)理使其有望應(yīng)用于不對稱氫化領(lǐng)域。

然而，天然單鐵氫酶僅存在于產(chǎn)甲烷古菌中，需要通過厭氧發(fā)酵，并在無氧條件下經(jīng)過分離純化得到。這個過程復(fù)雜且低效。此外，由于來源于古菌，對該酶進(jìn)行突變和定向進(jìn)化的基因操作也極具挑戰(zhàn)。以上這些因素導(dǎo)致單鐵氫酶的大規(guī)模培養(yǎng)和改造困難，嚴(yán)重限制了該酶的研究與應(yīng)用發(fā)展。

人工半合成策略通過將大腸桿菌 (E. coli) 異源表達(dá)的脫輔酶（apoenzyme）與有機(jī)合成的金屬輔因子仿生配合物（model complex）體外重組，得到具有催化活性的半合成單鐵氫酶（semisynthetic [Fe]-Hydrogenase），這一策略為解決該酶的大規(guī)模制備和改造困難帶來希望。然而，目前合成的金屬輔因子仿生配合物與天然金屬輔因子（FeGP）的結(jié)構(gòu)相去甚遠(yuǎn)，經(jīng)過重組得到的半合成單鐵氫酶活性不足天然單鐵氫酶的1%。因此，亟須合成結(jié)構(gòu)上更接近天然金屬輔因子的仿生配合物，以得到重組后活性更高、更穩(wěn)定的人工半合成單鐵氫酶。

圖1. a) FeGP輔因子的結(jié)構(gòu)和過去報(bào)道的仿生配合物結(jié)構(gòu)；b) 生物體內(nèi)天然金屬輔因子合成過程中的甲基化過程；c) 本文中合成的仿生配合物。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

針對天然FeGP 輔因子的吡啶配體結(jié)構(gòu)，通過合成路線的優(yōu)化，保護(hù)基團(tuán)及脫保護(hù)條件的篩選，成功制備高純度仿生配合物2a-4a和2-4，并通過核磁、高分辨質(zhì)譜、紅外和XRD等手段鑒定了結(jié)構(gòu)。其中仿生配合物4 的結(jié)構(gòu)與天然輔因子最為接近（僅缺失 GMP 基團(tuán)）。（圖2） 

圖2. a) 仿生配合物的合成路線；b) 仿生配合物的紅外光譜；c) 仿生配合物3-4的晶體結(jié)構(gòu)。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

合成了仿生配合物1-4后（其中仿生配合物1為對照，參考Nature Chemistry 7, 995–1002 (2015)）, 與大腸桿菌表達(dá)的脫輔酶經(jīng)過重組得到了一系列半合成單鐵氫酶，并分別測定了他們的正向（氫化）與反向（脫氫）反應(yīng)活性、重組速率、空氣穩(wěn)定性及反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，引入3-甲基后，半合成單鐵氫酶 jHmd-4 的催化活性較無3-甲基類似物jHmd-3提升了約35倍，正向/反向反應(yīng)活性分別達(dá) 38.5和33.5 U?mg?1，是目前半合成單鐵氫酶最高紀(jì)錄（表1）。此外，3-甲基的存在加速了模型配合物與脫輔酶的重組速度，在重組5分鐘內(nèi)便達(dá)到了其終活性的90%以上，這一速度接近天然FeGP輔因子于脫輔酶的重組速度（圖3c）。相較于jHmd-1, 吡啶上引入4-羥基后重組得到的jHmd-2活性明顯下降，其活性不足jHmd-1的一半。而在引入5-甲基后，活性從jHmd-2的0.7 ± 0.2 U?mg?1（正向）與0.3 ± 0.1 U?mg?1（反向）提升至1.1 ± 0.2 U?mg?1（正向）和1.1 ± 0.1 U?mg?1（反向）（表1）。有意思的是，5-甲基雖然未大幅提升半合成單鐵氫酶的活性，但卻給半合成酶的空氣穩(wěn)定性帶來了顯著提升—— 暴露于空氣中 30 分鐘后，jHmd-3和jHmd-4仍保留了約 65% 活性，而jHmd-1和jHmd-2的活性已降至初始活性的40%左右（圖3d）。

圖3. a) 重組過程示意；b) 重組酶的活性柱狀圖；c) 重組酶的活性隨重組時間的變化；d) 重組酶的活性隨暴露于空氣時間的變化。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

表1. 人工半合成單鐵氫酶的活性。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

隨后通過對單鐵氫酶晶體結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，3-甲基通過范德華作用與底物（methenyl-H?MPT?）上的苯環(huán)作用，限制了金屬輔因子和底物的運(yùn)動，促進(jìn)了氫化物轉(zhuǎn)移。5-甲基與蛋白中 Thr177 和 Trp148 殘基形成緊密的空間相互作用，穩(wěn)定了輔因子在蛋白腔中的構(gòu)象，最終給活性和穩(wěn)定性帶來了提升（圖4）。而4-OH 基團(tuán)與鳥苷的磷酸基團(tuán)存在空間排斥，最終導(dǎo)致了穩(wěn)定性和活性的下降。 

圖4. 天然單鐵氫酶的晶體結(jié)構(gòu)，PDB：6HAV。（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

本文針對天然 FeGP 輔因子的吡啶配體，通過精準(zhǔn)設(shè)計(jì)金屬輔因子仿生配合物的結(jié)構(gòu)，首次明確了 FeGP 輔因子中兩個甲基取代基的功能分工，揭示了它們的微觀調(diào)控作用，進(jìn)一步完善了天然單鐵氫酶的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系。通過人工半合成策略得到了迄今為止活性最高、穩(wěn)定性最高的人工半合成單鐵氫酶，為該類酶的應(yīng)用開發(fā)奠定了良好基礎(chǔ)。

這一成果近期發(fā)表在Journal of the American Chemical Society 上，文章第一作者為南京大學(xué)23級博士生王超，通訊作者為南京大學(xué)潘惠杰特聘研究員和西安交通大學(xué)黃鋼鋒教授。

潘惠杰特聘研究員 https://www.x-mol.com/groups/pan_huijie

黃鋼鋒教授https://gr.xjtu.edu.cn/zh/web/gangfeng.huang

文獻(xiàn)詳情：

Reconstitution of [Fe]-Hydrogenase with Model Complexes Reveals Functional Roles of Methyl Groups in the Metallocofactor

Chao Wang, Haoyu Li, Jinsi Li, Chang Wang, Jinmeng Yu, Seigo Shima, Gangfeng Huang, Hui -Jie Pan

J. Am. Chem. Soc.2025 

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c05803

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