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癌癥是人類健康的巨大威脅，由于癌細胞具有高度侵襲性，癌細胞轉(zhuǎn)移是癌癥患者死亡的主要誘因。因此，轉(zhuǎn)移抑制是許多癌癥相關(guān)療法的主要關(guān)注點。隨著超分子納米組裝的發(fā)展，原位自組裝納米纖維在癌細胞中表現(xiàn)出長期保留特性并顯著抑制其轉(zhuǎn)移行為。因此，通過合理設(shè)計外源性或內(nèi)源性刺激反應(yīng)的肽偶聯(lián)物，將其用于原位構(gòu)建納米纖維以全面抑制腫瘤轉(zhuǎn)移是可行的。

此外，對于癌癥轉(zhuǎn)移形成的遠端腫瘤的抑制在臨床癌癥治療中也很重要。近年來，通過化學療法和免疫療法的結(jié)合，化學免疫療法被廣泛用于來提高癌癥治療效率、逆轉(zhuǎn)耐藥性并最大限度地減少副作用。值得注意的是，越來越多的證據(jù)表明，化療藥物誘導的癌細胞凋亡/壞死可有效激活免疫系統(tǒng)以產(chǎn)生與腫瘤相關(guān)的新抗原。具體而言，化療誘導的癌細胞免疫原性細胞死亡(ICD)促進了抗原從細胞中的釋放。然后，釋放的抗原被成熟樹突狀細胞(DC)吸收，并隨后激活細胞毒性T淋巴細胞(CTL)以殺死癌細胞。不過，這種化療后的免疫反應(yīng)在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面不夠理想。因此，癌癥免疫治療（即免疫檢查點阻斷）與自噬抑制增強化療的組合對腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和侵襲具有顯著的抑制作用?；诖?，梁高林課題組設(shè)計了一種具有納米刷-納米粒子-納米纖維轉(zhuǎn)變特性的“三叉戟”前藥分子Nap?CPT?HCQ?Yp，通過細胞內(nèi)納米纖維的形成抑制原發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移，并通過化學免疫療法抑制遠端腫瘤的生長，從而在空間上抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

圖 1. 三叉戟前藥分子結(jié)構(gòu)及作用示意圖（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

三叉戟前藥分子Nap?CPT?HCQ?Yp自組裝肽骨架中包含三個功能性“矛”：(1)磷酸酪氨酸基團，作為堿性磷酸酶(ALP)催化的底物；(2)喜樹堿(CPT，一種化療藥物)；(3)羥氯喹(HCQ，一種自噬抑制劑)。其中，CPT和HCQ通過細胞內(nèi)羧酸酯酶(CES)可催化裂解的酯鍵與肽支架結(jié)合。Nap-CPT-HCQ-Yp在濃度高于6.3 μM時形成納米刷結(jié)構(gòu)。在癌細胞膜上與ALP作用去磷酸化后，Nap-CPT-HCQ-Yp首先轉(zhuǎn)化為Nap-CPT-HCQ-Y，納米刷轉(zhuǎn)變?yōu)榧{米粒子。癌細胞內(nèi)吞后，Nap-CPT-HCQ-Y在細胞質(zhì)中進行CES水解，納米粒子進一步轉(zhuǎn)化為納米纖維Nap-Y-NF，同時伴隨著CPT和HCQ的釋放。首先，Nap-Y-NF納米纖維的細胞內(nèi)形成抑制了癌細胞的遷移和侵襲能力。其次，釋放的HCQ通過抑制癌細胞的自噬來抑制癌細胞的自我保護過程，使它們對CPT的化學治療作用更加敏感。此外，自噬抑制增強化療誘導癌細胞凋亡/壞死，并伴有片段產(chǎn)生。這些片段隨后誘導癌細胞的ICD，促進抗原從細胞中釋放。然后，釋放的抗原被成熟的樹突狀細胞(DCs)吸收和呈遞，導致CTL激活以殺死癌細胞。然而，化療誘導的ICD提高了癌細胞上PD-L1的表達。PD-L1與CTL上的PD-1結(jié)合，降低了CTL的殺傷能力。為了解決這個問題，作者用檢查點阻斷療法補充了上述策略，以引發(fā)全身免疫反應(yīng)，從而有效抑制原發(fā)性腫瘤和遠端腫瘤（圖1）。

首先，作者通過HPLC分析證明了Nap?CPT?HCQ?Yp具有良好的穩(wěn)定性以及驗證了三叉戟前藥對ALP和CES的雙重響應(yīng)性，并且利用TEM表征驗證了前藥分子在酶觸發(fā)下的納米刷-納米粒子-納米纖維轉(zhuǎn)變。在10 μM的濃度下，Nap-CPT-HCQ-Yp最初自組裝成不均勻的納米刷構(gòu)型，經(jīng)ALP去磷酸化24 h后，納米刷進一步轉(zhuǎn)化為平均直徑為86.8±29.4 nm的 Nap-CPT-HCQ-Y納米粒子，之后通過CES水解24 h后，形成的納米粒子最終轉(zhuǎn)化為平均寬度為14.2±3.9 nm的Nap-Y-NF納米纖維。此外，作者還在體外研究了Nap-CPT-HCQ-Yp的酶促凝膠特性（圖2）。

圖 2. 酶處理前后三叉戟前藥分子的表征（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

接著，作者在過表達ALP和CSE的4T1細胞中對酶促納米結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的概念進行了驗證（圖3）。Nap-CPT-HCQ-Yp可以有效地進入細胞，并最初主要位于溶酶體中，后續(xù)會發(fā)生溶酶體逃逸行為。通過Bio-TEM觀察到前藥分子處理前后4T1細胞中的溶酶體結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的異常，表明三叉戟分子形成的納米纖維Nap-Y-NF可以破壞溶酶體結(jié)構(gòu)，從而促進從溶酶體中逃逸。而且，實驗證明Nap-CPT-HCQ-Yp的內(nèi)化涉及ATP依賴性轉(zhuǎn)運和小窩依賴性內(nèi)吞作用。在與細胞孵育8 h時，在細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了大量的納米纖維，表明大部分Nap-CPT-HCQ-Yp已轉(zhuǎn)化為Nap-Y并自發(fā)形成納米纖維Nap-Y-NF。此外，作者還設(shè)計了劃痕傷口愈合試驗證明了納米纖維的形成可以抑制癌細胞遷移。

圖 3. Nap-CPT-HCQ-Yp的細胞攝取、定位和細胞內(nèi)納米結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

接著，作者結(jié)合細胞毒性和蛋白質(zhì)印跡分析試驗驗證了自噬抑制策略顯著提高了三叉戟分子Nap-CPT-HCQ-Yp對癌細胞的化療效果，甚至比兩種游離藥物CPT和HCQ的效果更好。然后，作者進一步探討了Nap-CPT-HCQ-Yp處理的凋亡癌細胞是否可以觸發(fā)它們的下游ICD，并通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和流式細胞術(shù)研究了ICD相關(guān)生物標志物的水平，證實了Nap-CPT-HCQ-Yp的治療可以觸發(fā)癌細胞有效地產(chǎn)生ICD（圖4）。

圖 4. Nap-CPT-HCQ-Yp的細胞治療機制和誘導的免疫原性細胞死亡（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

然后，作者評估了前藥在體內(nèi)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的效果。與對照組相比，Nap?CPT?HCQ?Yp處理的小鼠腫瘤得到了明顯的抑制，并且可以最顯著地抑制腫瘤的肺轉(zhuǎn)移。在治療過程，Nap?CPT?HCQ?Yp還表現(xiàn)出優(yōu)異的生物安全性。值得注意的是，由于Nap-CPT-HCQ-Yp注射略微提高了腫瘤PD-L1的表達，作者進一步評估了Nap-CPT-HCQ-Yp和免疫檢查點阻斷PD-1抗體對4T1荷瘤小鼠的協(xié)同化學免疫治療功效。結(jié)果表明，“Nap-CPT-HCQ-Yp + aPD-1”的組合對原發(fā)性腫瘤的抑制效果最好。而且通過對包括CRT和HMGB1在內(nèi)的相關(guān)生物標志物進行免疫熒光染色研究了體內(nèi)ICD的產(chǎn)生，證實了通過組合“Nap-CPT-HCQ-Yp + aPD-1”治療有效產(chǎn)生ICD。此外，作者還在該組合治療的原發(fā)性腫瘤中觀察到最大量的活化細胞毒性T細胞，表明組合策略最大限度地激活了原發(fā)性腫瘤的免疫反應(yīng)。重要的是，Nap-CPT-HCQ-Yp和免疫檢查點阻斷PD-1抗體的組合還實現(xiàn)了對遠端腫瘤生長的顯著抑制（圖5）。

圖 5. 體內(nèi)自噬抑制增強化療聯(lián)合aPD-1抗體抑制原發(fā)性和遠端腫瘤生長（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

總結(jié)：東南大學梁高林教授團隊合理設(shè)計了一種具有納米刷-納米粒子-納米纖維過渡特性的“三叉戟”分子Nap-CPT-HCQ-Yp，在堿性磷酸酶和羧酸酯酶連續(xù)作用下，Nap-CPT-HCQ-Yp經(jīng)歷納米刷-納米粒子-納米纖維轉(zhuǎn)變，并伴隨著CPT和HCQ的釋放。形成的細胞內(nèi)納米纖維有效抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲行為。同時，釋放的CPT和HCQ通過自噬抑制增強化療協(xié)同誘導顯著的治療效果。此外，Nap-CPT-HCQ-Yp的化學療法增強了免疫原性細胞死亡，導致毒性T細胞的活化。最后，檢查點阻斷療法和Nap-CPT-HCQ-Yp介導的化學療法相結(jié)合可引發(fā)全身抗腫瘤免疫，從而在乳腺癌腫瘤模型中實現(xiàn)對原發(fā)性腫瘤和遠處腫瘤的有效抑制。該工作為設(shè)計“智能”多功能前藥以空間抑制腫瘤轉(zhuǎn)移提供了一種簡單可行的策略。

文章詳情：

Trident Molecule with Nanobrush–Nanoparticle–Nanofiber Transition Property Spatially Suppresses Tumor Metastasis 

Ge Gao, Yao-Wen Jiang, Wenjun Zhan, Xiaoyang Liu, Runqun Tang, Xianbao Sun, Yu Deng, Lingling Xu, and Gaolin Liang*

https://doi.org/10.1021/jacs.2c05743