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酶催化需要在最適pH條件下才能高效進(jìn)行，改變酶的pH適應(yīng)性一直是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。近日，華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李志敏教授課題組在酶促pH適應(yīng)性工程方向取得新進(jìn)展。Chemical Engineering Journal以“Endogenous microenvironmental engineering through targeted alteration of salt bridge network can effectively regulate enzymatic pH adaptation”為題對(duì)相關(guān)成果進(jìn)行了報(bào)道。

為了研究上述問(wèn)題，作者選擇了PfkB家族，主要包括核苷激酶、糖激酶、磷酸果糖激酶等，每類(lèi)酶只能?chē)?yán)格催化對(duì)應(yīng)底物的磷酸化反應(yīng)。一個(gè)有趣的現(xiàn)象是很難找到最適pH值低于6.0的磷酸果糖激酶，而許多核苷激酶在pH 4.0時(shí)表現(xiàn)出最高活性。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘，找到一個(gè)古菌來(lái)源的核苷激酶也可以磷酸化糖類(lèi)/糖磷酸類(lèi)底物，并且催化不同底物反應(yīng)的最適pH差異巨大，呈現(xiàn)pH混亂性。經(jīng)計(jì)算吉布斯自由能，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)對(duì)所有類(lèi)型的底物，實(shí)際上環(huán)境越堿性反應(yīng)越有利。為了排除pH混亂性是受不同底物理化性質(zhì)影響，作者重新設(shè)計(jì)了一個(gè)磷酸果糖激酶的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)，其可用底物改變而最適pH沒(méi)有任何變化。

后續(xù)，研究團(tuán)隊(duì)利用祖先序列重建，推斷并復(fù)活了PfkB家族的6個(gè)祖先酶。體外催化實(shí)驗(yàn)表明，祖先酶也具有pH混亂性。在序列比對(duì)具有不同遺傳關(guān)系的PfkB家族成員時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一段未被標(biāo)注的氨基酸短序列，該序列在不同屬來(lái)源酶之間差異很大，但在同一屬中保守。結(jié)合結(jié)構(gòu)和功能分析，猜測(cè)該區(qū)域很可能包含影響pH的殘基。后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在該區(qū)域理性設(shè)計(jì)突變即可顯著改變酶的pH適應(yīng)性甚至最適pH值。作者分析這是由于活性中心附近的鹽橋網(wǎng)絡(luò)改變所引起的，據(jù)此提出了一種有針對(duì)性的內(nèi)源性微環(huán)境工程策略，通過(guò)靶向改變鹽橋網(wǎng)絡(luò)來(lái)改變酶的pH適應(yīng)性。該工作首次從進(jìn)化角度考慮酶的最適pH值的影響因素，為酶促pH適應(yīng)性工程提供了有趣的新見(jiàn)解。

上述論文第一作者為華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院在讀博士生李宗霖，通訊作者為李志敏教授。成果得到了國(guó)家自然科學(xué)基金（32171478），國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2019YFA0904300)，天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升項(xiàng)目(TSBICIP-KJGG-009)和我校張江樹(shù)優(yōu)博培育計(jì)劃資助。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2022.136215