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北京大學化學與分子工程學院雷曉光課題組、唐淳課題組與合作者-北京生命科學研究所董夢秋課題組在《Nature Communications》雜志上發(fā)表合作論文，題目為：“Characterization of protein unfolding by fast cross-linking mass spectrometry using di-ortho-phthalaldehyde cross-linkers”。該研究報導了一類最新開發(fā)出的、賴氨酸選擇性的化學交聯(lián)劑DOPA （di-ortho-phthalaldehyde cross-linkers）；并且證明DOPA交聯(lián)劑具有不易水解、反應速度快、以及對低溫、低pH和變性劑具有良好兼容性等特點；該化學交聯(lián)劑被成功運用于捕獲蛋白質變性去折疊的中間態(tài)和終態(tài)構象，以及追蹤蛋白質構象變化等重要生命過程，從而推動了化學交聯(lián)質譜技術的發(fā)展，提升了其在蛋白質結構與功能解析中的應用前景。

化學交聯(lián)結合質譜技術 (chemical cross-linking coupled with mass spectrometry, CXMS) 是近年來迅猛發(fā)展的一種檢測蛋白質結構和蛋白質相互作用的方法。隨著質譜儀器以及交聯(lián)數(shù)據(jù)搜索算法的發(fā)展，CXMS技術已經獲得了長足的進步。除此之外，新型交聯(lián)劑的開發(fā)也是推動該技術發(fā)展的重要方向之一。賴氨酸是一類含量豐富的氨基酸 (約7%)，CXMS技術中應用最為廣泛的交聯(lián)反應也是基于賴氨酸側鏈氨基的反應?，F(xiàn)階段商業(yè)可得的賴氨酸交聯(lián)劑大多包含琥珀酰亞胺酯或亞氨酸酯活性基團，如雙琥珀酰亞胺辛二酸酯 (DSS)。雖然此兩類活性酯獲得了一定的應用，但其存在易水解而失效的缺陷。因此開發(fā)一類不水解、高選擇性的賴氨酸交聯(lián)劑具有重要意義。

基于此，為了進一步豐富交聯(lián)劑的種類，研究人員發(fā)展了一系列基于鄰苯二甲醛 (ortho-phthalaldehyde) 結構的賴氨酸選擇性交聯(lián)劑，命名為DOPA，DOPA交聯(lián)劑可以有效地連接蛋白質表面兩個賴氨酸殘基，圖1。尤其是DOPA2交聯(lián)劑在蛋白混合物上展現(xiàn)出較高的交聯(lián)反應效率，圖2。

圖1. DOPA交聯(lián)劑與賴氨酸特異性發(fā)生交聯(lián)反應

圖2. DOPA交聯(lián)劑在十個蛋白混合物中的交聯(lián)表現(xiàn)

研究人員進一步探究DOPA交聯(lián)劑性質時，發(fā)現(xiàn)DOPA交聯(lián)劑展現(xiàn)出了不水解、反應速度快、耐低溫、低pH和變性劑的特性，因此決定將其運用到蛋白質變性去折疊過程中結構動態(tài)變化研究。在金黃色葡萄球菌核酸酶（SNase），牛血清白蛋白（BSA）和牛胰腺核糖核酸酶A（RNaseA）變性去折疊過程中，DOPA2成功捕捉到了蛋白從折疊態(tài)到去折疊態(tài)的轉換。如DOPA2捕獲了牛胰腺核糖核酸酶A（RNaseA）在8M尿素中的連續(xù)變性過程，再結合分子動力學模擬，獲得了RNaseA去折疊中間體的構象集合，圖3。DOPA交聯(lián)劑的這些特點成功拓展了CXMS技術的應用范圍，使該技術研究蛋白質空間結構動態(tài)變化成為可能。

圖3. DOPA2交聯(lián)質譜技術分析RNaseA在8M尿素中的變性過程

雷曉光教授，董夢秋研究員和唐淳教授為該論文共同通訊作者。董夢秋課題組王建華博士和雷曉光課題組唐毓良博士為該文章共同第一作者。該工作還得到了中國科學院精密測量科學與技術創(chuàng)新研究院龔洲博士，馬薩諸塞大學醫(yī)學院Rohit Jain博士，原董夢秋課題組譚丹博士，中科院生物物理所葉克窮研究員，北京生命科學研究所黃牛研究員、周宇博士，雷曉光課題組肖凡、李強博士以及云南大學柳樹群教授的支持。上述研究得到了科技部-國家重點研發(fā)計劃-蛋白質機器與生命調控專項、國家自然科學基金委、北京分子科學國家研究中心、北大-清華生命科學聯(lián)合中心、中科院和北京市卓越青年科學家計劃等科研項目和研究機構的資助。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-28879-4

參考資料：https://www.chem.pku.edu.cn/kyjz/136639.htm