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納米孔道是一種自然界廣泛存在的可運(yùn)輸離子、水分子和生物分子的納米級(jí)孔道。生物納米孔道可由天然的蛋白質(zhì)構(gòu)成。近年來(lái)，研究人員利用電場(chǎng)力將單個(gè)分子牽引至單個(gè)生物納米孔道內(nèi)，排開孔道內(nèi)的部分離子，進(jìn)而產(chǎn)生特征的離子流阻斷信號(hào)反應(yīng)了單分子的化學(xué)組成、質(zhì)量、結(jié)構(gòu)等信息，這便是納米孔道單分子電化學(xué)的基本原理。納米孔道內(nèi)壁氨基酸殘基、質(zhì)子、離子及單個(gè)傳輸分子之間發(fā)生的協(xié)同弱相互作用還會(huì)引起限域空間內(nèi)幾十個(gè)離子的瞬態(tài)變化，其產(chǎn)生的極微小的離子流信號(hào)常常被掩蓋在納米孔道的電流噪聲中，使得這些單分子特征信息無(wú)法獲取。

圖1. 納米孔道中的單分子特征離子指紋圖譜分析方法(A)納米孔道單分子電化學(xué)測(cè)量原理圖（左）；單個(gè)模型分子poly(dA)₄通過(guò)Aerolysin納米孔道產(chǎn)生的離子流特征信號(hào)（右上），及該信號(hào)被經(jīng)驗(yàn)?zāi)B(tài)分解(EEMD)后獲得的本征模態(tài)函數(shù)(IMF)；(B)經(jīng)希爾伯特-黃瞬時(shí)頻率分析變換后的單分子特征離子頻率譜圖；(C)低頻域區(qū)下單分子特征離子頻率譜圖。

研究團(tuán)隊(duì)將單個(gè)單個(gè)模型生物分子poly(dA)₄穿過(guò)Aerolysin蛋白質(zhì)孔道所獲得的離子流電號(hào)經(jīng)過(guò)經(jīng)驗(yàn)?zāi)B(tài)分解(EMD)及希爾伯特譜分析(HAS)，獲得了信號(hào)在整個(gè)測(cè)量頻率相應(yīng)范圍內(nèi)的單分子特征離子頻率譜圖，提取了特征峰值頻率(f_m)和峰值振幅(a_m)。通過(guò)研究不同pH、電解質(zhì)濃度及類型、外加電壓、溫度等條件下的單分子特征頻率指紋圖譜變化，發(fā)現(xiàn)離子、單個(gè)傳輸分子、納米孔道內(nèi)壁氨基酸殘基間的可逆平衡調(diào)節(jié)了質(zhì)子、離子與納米孔道的結(jié)合/解離過(guò)程，影響了離子流電信號(hào)的低頻組分。進(jìn)一步，研究團(tuán)隊(duì)總結(jié)了特征頻率的物理化學(xué)特性，即f_m反映了納米孔道內(nèi)離子與孔道內(nèi)壁氨基酸殘基間的解離速率，a_m描述了納米孔道內(nèi)壁氨基酸殘基在限域相互作用網(wǎng)絡(luò)下的結(jié)合離子數(shù)目。

圖2.特征峰值頻率(f_m)和峰值振幅(a_m)的影響因素研究(A) pH；(B)離子強(qiáng)度；(C)離子種類；(D)實(shí)驗(yàn)溫度；(E) 施加電壓。揭示離子相互作用網(wǎng)絡(luò)的峰值頻率(上)和峰值振幅(下)。

圖3. 單分子特征離子指紋圖譜及預(yù)測(cè)研究(A)系列238位點(diǎn)突變型AeL納米孔道238（左）及特征峰值頻率(f_m)的相關(guān)性分析（右）；(B)特征峰值頻率(f_m)與突變氨基酸等電點(diǎn)，單分子阻斷時(shí)間，突變氨基酸范德華體積間的非線性依賴關(guān)系；(C) 238位點(diǎn)突變型AeL納米孔道的單分子特征離子指紋圖譜預(yù)測(cè)模型。

為進(jìn)一步驗(yàn)證單分子特征離子指紋圖譜的普適性，研究人員構(gòu)建了系列238位點(diǎn)突變型Aerolysin納米孔道，改變了納米孔道靈敏探測(cè)區(qū)域內(nèi)氨基酸殘基與單個(gè)生物分子的相互作用，歸納了氨基酸殘基的化學(xué)特性對(duì)頻率指紋特性的影響規(guī)律?；瘜W(xué)加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在無(wú)分析物存在于納米孔道的情況下，特征峰值頻率(f_m)與體系電導(dǎo)相關(guān)；而在有單個(gè)分子通過(guò)納米孔道的時(shí)候，特征峰值頻率(f_m)與突變位點(diǎn)氨基酸殘基化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性顯著增加。進(jìn)一步，利用多元回歸分析建立了單分子頻率指紋圖譜經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，描述了離子指紋圖譜特征f_m和氨基酸殘基電性、范德華體積、親疏水性等物理化學(xué)特征間的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了對(duì)突變型納米孔道離子指紋圖譜頻率特征的預(yù)測(cè)。該方法有助于精準(zhǔn)探測(cè)納米孔道單分子動(dòng)態(tài)相互作用，實(shí)現(xiàn)納米孔道單分子蛋白質(zhì)測(cè)序。

相關(guān)成果以“Single-Molecule Frequency Fingerprint for Ion Interaction Networks in a Confined Nanopore”為題(VIP Paper)，發(fā)表于《德國(guó)應(yīng)用化學(xué)》(Angewandte Chemie International Edition)文章鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202108226

該工作得到了國(guó)家自然科學(xué)重大科研儀器研制項(xiàng)目及優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目、南京大學(xué)化學(xué)和生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院的支持，南京大學(xué)化學(xué)專業(yè)博士研究生李欣怡為論文的第一作者，應(yīng)佚倫教授和龍億濤教授為論文的通訊作者。

參考資料：https://chem.nju.edu.cn/3a/06/c12639a539142/page.htm