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2025年8月19日，北京大學化學與分子工程學院，北大-清華生命科學聯(lián)合中心雷曉光團隊與美國加州大學洛杉磯分校的K. N. Houk 團隊在《PNAS》上在線發(fā)表研究論文，題為："Aspartic acid residues in BBE-like enzymes from Morus alba promote a function shift from oxidative cyclization to dehydrogenation"。該工作對白桑（Morus alba）中類BBE酶催化的氧化環(huán)化與脫氫反應的催化機制以及選擇性進行了探究，證實了類BBE酶中的一個天冬氨酸殘基可以作為催化堿通過去質(zhì)子化促進二烯產(chǎn)物的產(chǎn)生；而缺失該殘基則會導致氧化環(huán)化發(fā)生。

在實驗室的前期研究中，雷曉光課題組發(fā)現(xiàn)了?？浦参镏?/span>類BBE酶具有催化氧化脫氫、氧化環(huán)化以及分子間Diels-Alder反應的活性，并且解析了白桑中分子間Diels-Alder反應酶的自然演化歷程（Nat. Chem. 2020, 12, 620; Nat. Catal. 2021, 4, 1059; Nat. Commun. 2024, 15, 2492; Acc. Chem. Res.2024, 57, 2166）。在這些類BBE酶中存在一些功能雜泛性酶，它們能夠同時催化氧化脫氫以及氧化環(huán)化反應的，比如MaDS1和MaDS6。這種功能雜泛性在類BBE酶中并不常見，氧化脫氫酶與氧化環(huán)化酶精確調(diào)控不同氧化路徑的分子機制仍不清楚。

在本研究中，作者首先分別解析了MaDS1-FAD（圖1A&B）以及MaDS1-FAD-氧化脫氫產(chǎn)物復合物的晶體結(jié)構(gòu)，并在復合物晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上用底物moracinC進行分子對接（圖1C），并根據(jù)分子對接結(jié)果進行了丙氨酸掃描突變試驗。結(jié)果表明Y116能夠與底物的酚羥基形成氫鍵相互作用，對于底物識別非常關(guān)鍵；而D175/R314/D410能夠形成氫鍵相互作用網(wǎng)絡(luò)輔助氧化脫氫反應的發(fā)生，其中D175對于氧化脫氫反應活性極為重要（圖1D&E）。

圖1.MaDS1晶體結(jié)構(gòu)及基于結(jié)構(gòu)的突變研究

隨后，通過同源序列比對，作者發(fā)現(xiàn)Y116在所有氧化酶中都是保守的，而D175和R314則在氧化脫氫酶中保守，在單功能氧化環(huán)化酶中對應D175的氨基酸則為較為疏水的L或者V，對應R314的氨基酸則為S，這也能夠表明D175和R314可能存在著共進化的關(guān)系（圖2A）。在晶體結(jié)構(gòu)中，D175距離氧化脫氫中所需要被去質(zhì)子化的甲基距離較近，因此作者推斷該氨基酸可能作為催化堿對底物進行去質(zhì)子化，因而將該天冬氨酸突變?yōu)樘於０坊蛘吖劝彼?，結(jié)果表明D175E突變體仍具有氧化脫氫的活性，說明D175的羧酸基團對于氧化脫氫活性至關(guān)重要（圖2B）。另外，在其他單功能氧化脫氫酶上講該天冬氨酸突變?yōu)槔i氨酸能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)變?yōu)閱喂δ艿难趸h(huán)化酶，而在單功能氧化環(huán)化酶的該位置引入天冬氨酸基團也可以使其獲得氧化脫氫的活性。該結(jié)果證實了這一位點取代在氧化環(huán)化酶（OCs）向脫芳構(gòu)化酶（DSs）進化過程中的關(guān)鍵作用。綜合上述發(fā)現(xiàn)，我們證實了D175位羧基對促進白桑（M. alba）BBE類酶催化氧化脫氫反應的重要功能（圖2C）。

圖2.D175是對于氧化環(huán)化反應至關(guān)重要的氨基酸殘基

最后，作者密度泛函理論（DFT）計算以深入探究氧化反應的分子機制：該反應首先發(fā)生底物向FAD的負氫轉(zhuǎn)移，形成烯丙基碳正離子中間體，隨后在有無D175的參與的情況下有兩條反應路徑。沒有D175參與的情況下，中間體去質(zhì)子化形成醌式中間體，該中間體隨后可以發(fā)生一步在空腔外自發(fā)的6π電環(huán)化反應得到氧化環(huán)化的產(chǎn)物（能壘22.0 kcal/mol），分子動力學（MD）模擬也表明該中間體無法在酶口袋內(nèi)穩(wěn)定存在，印證了這一結(jié)論；而另一條路徑則是通過D175對于碳正離子中間體去質(zhì)子化，隨后形成了氧化脫氫產(chǎn)物（能壘22.3 kcal/mol）。該計算結(jié)果解釋了MaDS1對氧化環(huán)化的選擇性高于氧化脫氫（圖3）。

圖3.MaDS1催化氧化環(huán)化及氧化脫氫反應的DFT計算

北京大學雷曉光課題組博士研究生郭念昕和南京理工大學的博士研究生顧軍為本文的共同第一作者，北京大學雷曉光教授，加州大學洛杉磯分校K. N. Houk教授和原北京大學雷曉光團隊副研究員，現(xiàn)武漢大學高磊教授為論文的共同通訊作者。該工作得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金委員會、The National Science Foundation of the US、北京分子科學國家研究中心、北大-清華生命科學聯(lián)合中心、新基石基金會等項目或單位的資助。